Experimentos en drosófila han demostrado que la pérdida de tuberina produce un defecto en el ciclo celular que ocasiona una repetición de la fase S sin entrar en la fase M (Ito N et al 1999). En estudios, se descubrió que la tuberina y la hamartina eran miembros clave de la cascada de señales PI3K/PKB(Akt)/mTOR/S6K que regula la captación de nutrientes, el tamaño celular y la proliferación celular (Potter CJ 2001, Tapon N 2001, Stoker HT 2003)

Ambos genes son del tipo supresor de tumores y causan la aparición de tumores (angiolipomas, angiofibromas, astrocitomas etc..) mediante la existencia de mutaciones somáticas (hipótesis de two hit). Para la aparición de un tumor no es suficiente la presencia de una mutación en la línea germinal sino que hace falta una mutación somática (second hit), que dará lugar a la proliferación clonal de una célula.

Se piensa que ambos genes controlan el crecimiento celular y juegan un papel importante en el desarrollo temprano del cerebro y de la piel.

El hallazgo de mutaciones en estos pacientes confirma el diagnóstico clínico y nos permiten dar consejo genético a estas familias, que se enfrentan a una enfermedad de herencia autosómica dominante, ante su deseo de tener nueva descendencia.

Debido al alto porcentaje de aparición de mutaciones de carácter espontáneo, nos decantamos por un análisis directo de ambos genes mediante técnicas basadas en la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) seguidas de la secuenciación directa de los genes TSC1 y TSC2.

En caso de un hallazgo positivo, se estudian los familiares probando con la finalidad de confirmar o descartar la existencia de una mutación “de novo” en el mismo, ya que se ha visto que en muchos casos la enfermedad puede pasar desapercibida en los ascendientes y mostrarse más agresiva en los descendientes apareciendo en este caso un paciente “sin historia familiar” de la enfermedad.

Las mutaciones más comunes suelen ser inserciones o delecciones, aunque también hay mutaciones puntuales que redundan en el cambio de algún aminoácido de la proteína codificada en el gen.

Secuenciación Sanger en TSC1 y TSC2- GENÉTICA MOLECULAR APLICADA AL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

Protocolo para pruebas genéticas.

El objetivo es diagnosticar genéticamente a pacientes con diagnóstico clínico de Esclerosis Tuberosa, es decir, encontrar la alteración genética responsable de la enfermedad en los pacientes.

En la PRIMERA FASE se buscan mutaciones en las regiones del gen que codifican los aminoácidos de las proteínas (exones) de los genes TSC1 y TSC2. En estas regiones se localizan la mayor parte de las mutaciones descritas. La prueba puede llevarse a cabo con DNA obtenido de sangre o DNA obtenido de frotis bucal. Para ellos se realizará la secuenciación exónica de TSC1 y TSC2 mediante NGS. También se estudiaran deleciones y duplicaciones en los genes TSC1 y TSC2 para ellos se hará un estudio MLPA de TSC1 y TSC2. La prueba debe realizarse con DNA obtenido de sangre.

Con la aproximación de la primera fase se diagnostican la mayoría de enfermos (aproximadamente el 80% de los pacientes). En los casos que en la primera fase no se llegue al diagnóstico se procederá a la SEGUNDA FASE en la que se secuenciará todo el gen con objeto de estudiar mutaciones no descritas en las regiones no estudiadas en la primera fase (intrones y zonas UTRS, son zonas del gen que si bien no codifican aminoácidos de las proteínas TSC1 y TSC2 pueden tener un efecto a nivel de proteína. La prueba puede llevarse a cabo con DNA obtenido de sangre o DNA obtenido de frotis bucal. Para ellos se realizará la Secuenciación completa de TSC1 y TSC2 (incluidos exones, intrones y zonas UTR). Para comprobar si las mutaciones encontradas en estas regiones pueden afectar a la proteína y, por tanto, causantes de la enfermedad es necesario realizar un estudio de RNA obtenido de sangre.

En algunos casos la enfermedad se debe a la presencia de mutaciones de estos genes localizadas a nivel del tejido afectado (en mosaicismo) por ello los pacientes que no hayan podido ser diagnosticado en las fases previas pasarán a la TERCERA FASE donde se realizará la secuenciación completa de TSC1 y TSC2 en tejidos candidatos. La prueba puede llevarse a cabo con DNA obtenido de angiofibromas o DNA obtenido de dientes.